超净工作台在生物学实验中的应用

点击数：17812022-03-08 13:54:29　来源: 青岛净化、山东净化公司、山东空气净化工程

新闻摘要:主要仪器和试剂：DMEM培养基、胰蛋白酶、I型胶原酶、，二甲基亚砜、MTT、small牛血清、fetal牛血清、annexinv凋亡检测试剂盒、mondel680酶标仪、垂直流式超净工作台、CO2细胞培养箱、倒置显微镜和流式细胞术

近年来，随着组织工程和再生医学的迅速发展，脂肪干细胞因其来源丰富、免疫功能低下、具有多向分化潜能等优点成为研究热点。然而，以往的研究大多集中在ADSCs多向分化潜能在组织工程和再生医学中的应用，而对ADSCs分泌功能在组织损伤修复中的作用关注甚少。本实验利用super clean workbench观察和研究了ADSCs分泌功能对成纤维细胞的生物学效应，探讨了ADSCs分泌功能促进伤口愈合的机制

材料和方法
1主要仪器和试剂：DMEM培养基、胰蛋白酶、I型胶原酶、，二甲基亚砜、MTT、small牛血清、fetal牛血清、annexinv凋亡检测试剂盒、mondel680酶标仪、垂直流式超净工作台、CO2细胞培养箱、倒置显微镜和流式细胞术
2脂肪干细胞分离和培养：从腹部手术患者中提取约59个皮下脂肪组织，无菌条件下用剪刀去除血管等组织碎片，用含双抗体的PBS溶液反复浸泡冲洗3次，每次约5min，用眼剪将脂肪组织剪成约1mm3的碎片，放入0.1%Ⅰ型胶原酶中，在37℃水浴中振荡消化1H；加入等体积的l0%胎儿牛血清精消化液后，用200目细胞筛过滤，600g离心10min，丢弃上层脂肪和上清液，用l0%胎儿牛血清培养基复悬沉淀，接种于培养瓶中，置于37℃和5%的CO2培养箱中常规培养。2天后，更换溶液，将细胞传代至80%
制备ADSCs培养上清液：选择生长良好的第三代ADSCs细胞，接种于75cm2的培养瓶中。当生长**80%融合后，用15ml血清培养基DMEM代替。培养3天后，收集上清液。通过o.22μM滤膜过滤纯化上清液。分装，一个80。C.冷冻备用
培养4例人皮肤成纤维细胞：原代细胞采用组织块法培养，置于10%small牛血清培养基中，在37℃和5%C02培养箱中培养

5成纤维细胞增殖测定：MTT法。取第三代成纤维细胞3×10孔接种于12孔板上，常规培养24小时后丢弃上清液，设实验组和对照组。实验组用adsc-cm和2%的small牛血清中剂量配制，对照组只用2%的small牛血清中剂量配制，每组3口井。每组加入相应培养基的LML。连续培养3天后，每个孔中分别加入5gL mtt100μL。在37℃和5%C02下培养4小时后，精培养：吸取并丢弃上清液，向每个孔中加入750μL元宝枫，连续培养1分钟后，轻轻摇动以溶解紫蓝色沉淀，然后μL孔移动**96孔板，每个孔重复5次。通过微孔板读数器测量490nm波长处的吸光度值。

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